3.1　方法原理

3.1.1　荧光的产生

所有电子自旋都配对的分子的电子态，称为单重态（Singlet State），用S表示。分子中电子对的电子自旋平行的电子态称为三重态（Triplet State），用T表示。

基态分子吸收了特定频率辐射能量后，由基态（S₀）跃迁至第一、第二激发单重态（S₁，S₂）的任一振动能级，处于激发态的分子，通过无辐射跃迁的形式放出部分能量（转化为分子的振动能或转动能等）回至S₁态的最低振动能级，然后再以辐射跃迁的形式放出能量，回至S₁态的各振动能级，该过程就产生了荧光（S₁→S₀）；当S₁态与激发三重态（T₁）之间发生振动耦合，以无辐射跃迁的形式回至T₁态，并经T₁态的最低振动能级回至S₀态的各振动能级，则产生磷光（T₁→S₀），如图3-1所示。

振动弛豫（VR）是在分子的同一电子能级中，分子由高振动能级向该电子态的最低振动能级的非辐射跃迁。振动弛豫过程的速率极大，在10^-14～10^-12s内即可完成。V=0表示基态的最低振动能级。内转化（ic）是相同多重态的两个电子态之间（S₂→S₁，S₁→S₀）的非辐射跃迁。体系间窜跃（isc）是指不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁。

3.1.2　荧光激发光谱

荧光激发光谱是指不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。是通过固定荧光发射波长，扫描荧光激发波长，以荧光强度（F）为纵坐标，激发波长（λ_ex）为横坐标，所绘制得到的曲线。

3.1.3　荧光发射光谱

荧光发射光谱通常称为荧光光谱（Fluorescence Spectrum），表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度，是通过固定荧光激发波长，扫描荧光发射波长，以荧光强度（F）为纵坐标，发射波长（λ_em）为横坐标，所绘制得到的曲线。

图3-2是萘的荧光激发光谱和荧光发射光谱，其激发光谱有2个峰，而发射光谱仅一个峰。

但是荧光发射光谱的形状与激发波长无关。这是因为荧光分子发射荧光只是从第一电子激发态的最低振动能级开始，在其他激发态振动不发射荧光。

荧光发射光谱的形状与荧光激发光谱极为相似，且呈镜像对称关系。这是由于基态分子中能级的分布和第一电子激发态中最低振动能级的分布情况类似。如图3-3是蒽的激发光谱和发射光谱。

3.1.4　荧光强度与浓度的关系

荧光是物质在吸光之后所发射的辐射，溶液的荧光强度（I_f）与该溶液吸收的光强度（I_a）以及该物质的荧光量子产率（Y_f）有关，即：

I_f=Y_fI_a

而吸收的光强度等于入射的光强度（I₀）减去透射的光强度（I_t），于是有：

由朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律可知：

代入得：

由得

当abc非常小（≪0.05）时，则，所以

当用摩尔吸光系数ε代替a时，得：

由上述可知，某种荧光物质在一定频率及强度的激发光照射下，只有当溶液的浓度足够小，对激发光的吸光度很低时，所测得溶液的荧光强度才与该物质的浓度成正比。若浓度较高，荧光强度与浓度之间的线性关系将发生偏离，有时甚至随溶液浓度的增大而降低。

利用低浓度下荧光物质的荧光强度与浓度成正比的特点，可对物质进行定量测定。