第一节　牛乳的热稳定性

一、加热时牛乳蛋白质的变化

牛乳蛋白质受热变性，温和的热处理（即生产上常用的热处理）不影响乳蛋白的一级结构和肽键，而是作用于二级结构和三级结构。牛乳蛋白质在80℃左右开始变性，而且这种变性是部分可逆的。

（一）酪蛋白的变化

乳蛋白对加热是否稳定的性质称为热稳定性。通常以在给定的温度下，产生可见的乳凝固所需要的时间来定义热稳定性。酪蛋白比较稳定；乳清蛋白基本对热不稳定，容易发生热变性。酪蛋白溶液于100℃下加热30min，几乎没有变化；于120℃下加热30min，可发现电泳图谱的变化，γ-酪蛋白及β-酪蛋白的峰趋向扁平，发生部分水解和脱磷酸；于140℃以上的温度加热时，则开始凝固。事实上，所有的天然酪蛋白都有不同程度的化学改性，因此被认为是一种天然的变性蛋白。当酪蛋白遭受强烈的热处理时，它确实发生一些变化，其中主要是水解。

酪蛋白不易变性，而且乳的热凝固对温度的依赖性比蛋白热变性对温度的依赖性弱得多。加热后酪蛋白发生凝集，并由于加热后乳浆组成变化很大，即使恢复到原来的环境，聚集体也不能再溶解，甚至添加断裂氢键的试剂，减少—S—S—键的联结等，聚集体仍保持原样。因此，酪蛋白在加热后无疑是发生了化学变化。研究显示，高温下的酪蛋白经历了脱磷酸、部分水解和几步交联反应。

120℃加热30min后产生-胨氮（PPN）4.7%～6%（以总氮计）。杀菌前牛乳中的-胨是组成β-酪蛋白和脂肪球膜蛋白（pH4.6，牛乳煮沸时蛋白质不沉淀）的解朊部分。灭菌牛乳中所产生的-胨最有可能来自肽键水解或裂解，但这方面的机制至今尚未阐明。120℃加热30min，可增加牛乳中非蛋白氮（NPN）含量，为总氮的5.5%～7.5%。NPN溶于12%的三氯醋酸。NPN的产生很有可能是蛋白加热中谷氨酸和天冬氨酸脱氨基作用，释放氨气所造成的。关于这一说法尚未有确凿证据，但对酪蛋白盐溶液（pH6.9）135℃加热30min后，发现NPN的生成量与蛋白质的酰胺氮相等。通常巴氏杀菌、UHT产生的-胨氮或NPN是微量的。

1.热处理对酪蛋白的某些物理性质的影响

酪蛋白在100℃以下加热，虽然其化学性质没有什么变化，但加热对其物理性质却有明显影响。牛乳经63℃以上的温度加热后，用酸或凝乳酶凝固时，凝乳的物理性质发生变化；牛乳经63℃以上温度加热后，加酸生成的凝块细小而柔软，用凝乳酶凝固的凝块也比较柔软；用100℃处理时尤为显著，其凝固时间则随加热温度的升高而延长。牛乳加热时酪蛋白的变化与乳清蛋白的热变性有复杂的关系，如牛乳经高温加热后，由于乳清蛋白变性而使黏度增大，影响稀奶油的分离；而经63℃，30min的低温保持杀菌后立即冷却的牛乳无此现象。我们将在后文中对此进行详细论述。

2.酪蛋白体积的变化

低于90℃的热处理对蛋白的体积变化影响很小，UHT杀菌后胶束体积增加，Mohammad和Fox（1987年）研究了140℃10min热处理的酪蛋白胶束，发现其直径增加，胶体粒子的分布范围缩小。Dalgleish等人（1987年）测得130℃加热时，酪蛋白的平均半径在起始阶段缓慢增加，至有可见絮凝物生成前，半径迅速增加。

pH也影响受热酪蛋白的半径变化。加热时pH由6.7变化为6.9，其平均直径增加，若pH继续上升至7.2，则胶体半径明显下降。

加热过程从酪蛋白中解离的小颗粒物质明显增加，许多研究表明，在高温情况下κ-酪蛋白从酪蛋白胶体上解离出来，解离量和加热的温度与时间、酪蛋白浓度、可溶性盐、pH密切相关。

Tomotada等研究了加热导致的酪蛋白胶束大小的变化。通过离心方法获得不同大小的酪蛋白胶束。采用Sephacryl S-100凝胶过滤柱分析胶束大小的分布。除了140℃加热外，则无论在加热过程是否存在乳清蛋白，大胶束和中等大小胶束的体积分布都没有发生变化，但小胶束的大小上升为中等大小。而在140℃加热时，若有乳清蛋白存在，则大胶束聚合了，而小胶束和中胶束的大小则上升为大胶束的尺寸。当胶束混合物加热超过120℃时，中胶束和小胶束都上升到大胶束的尺寸。因此中胶束通过与小胶束结合而使体积增加，而小胶束通过与中胶束和大胶束结合使体积增加为大胶束大小。这个结果表明小胶束是胶束体积增加的重要因素，乳清蛋白则是胶束结合的促进剂。

我们设想胶束表面会发生一些变化，因此胶束可能会在加热过程中相互反应，甚至在没有乳清蛋白存在时，这种反应仍然存在。为了使相互反应成为可能，胶束表面的蛋白质尽量互相不结合，而在加热过程中释放，我们测定了释放的蛋白质的数量和组成。结果发现加热到120℃时释放了4%的蛋白质；当加热至140℃时释放的蛋白质数量增加至20%。释放的蛋白质包括β-酪蛋白、α_s1-酪蛋白和κ-酪蛋白，较大的胶束似乎释放出更多的β-酪蛋白。α_s1-酪蛋白和κ-酪蛋白的比例为1（不考虑胶束大小）。根据1989年Ono报道α_s1-κ-酪蛋白复合物是定位于胶束表面的酪蛋白胶束的亚基之一。由此表明加热时胶束表面的酪蛋白复合物释放出来。

考虑到释放的蛋白质是胶束表面的亚基，因此需要分析表面的亲水性。加热到120℃时大酪蛋白胶束的亲水性翻倍，而中胶束和小胶束的亲水性并没有变化。既然大胶束的体积在加热时没有发生变化，则说明释放出蛋白质后而暴露的表面亲水部分没有被其他结合的胶束所覆盖，这些区域保持在胶束表面。这就解释了为什么当小胶束和较大胶束通过加热而和暴露的疏水部分结合时，小胶束和中胶束的疏水性没有变化。研究还表明疏水区域并未大到足以结合大或中胶束，但足以结合小胶束。

由此得出如下结论，加热时α_s1-κ-酪蛋白亚基从酪蛋白胶束表面释放，疏水区域暴露。暴露的部分并未大到足以结合大或中胶束，但可以结合小胶束。胶束表面的疏水性通过吸收变性的乳清蛋白而增加，这促进了酪蛋白胶束的相互结合。小胶束在胶束体积增加方面似乎起关键性作用。

3.酪蛋白的热凝固

酪蛋白的脯氨酸（占总酪蛋白的11.2%）能阻止蛋白质凝聚所需的氢键形成，所以对热较稳定。当受热强度达到125℃、60min，酪蛋白开始凝聚变性，但这种强度的加热几乎不会出现在乳制品生产中。稍弱的加热强度会导致酪蛋白折叠结构的解体，如UHT杀菌会使得酪蛋白变得松散，颗粒的直径增加。酪蛋白热凝固的原因不同于β-乳球蛋白热变性的原因。高温下酪蛋白经历了脱磷酸、部分水解和几步交联反应。

蛋白质加热过程中涉及丝氨酸磷脂、硫醇、二硫化物、赖氨酸和酰胺侧链的反应，也有部分肽链可能发生裂解。酪蛋白侧链极易发生热诱导反应。球状乳清蛋白则由于热变性，很容易展开其多级结构。多肽链中的肽键基本上是反式构象（trans），但肽链展开情况下易发生异构化，生成不稳定的顺式（cis）构象，但脯氨酸残基是个例外，它的顺、反式构象均相当稳定，因此其异构化比较困难。一旦发生异构化则可能影响到蛋白质的反应速率，且冷却后不易恢复到原来天然的状态。但有关这类反应的数据仍很零碎，因此我们不可能仅仅基于活化能之类的基本参数对它们进行比较。

120℃加热1h有近50%的酪蛋白酸钠去磷酸化，5h后去磷酸化彻底完成。TCA可溶性氮的形成速度远低于P的释放速度（约20%的总氮在120℃5h内是稳定的），这说明TCA可溶性P的增加不是因为蛋白质水解产生的。部分去磷酸化的酪蛋白比其他酪蛋白的热稳定性更好，可以结合更少量的Ca^2＋。可以认为这两个因素与酪蛋白的热凝结有很大关系。

4.酪蛋白酸盐的裂解

热处理能使酪蛋白的磷酸丝氨酸裂解，产生磷酸盐（酯）；该反应常在脱脂乳或酪蛋白盐溶液100～140℃，加热1h情况下发生。酪蛋白的磷酸盐（酯）裂解反应速率随pH值从6.0上升到7.0而增加。在牛乳正常pH值范围内，该裂解反应的活化能分别是：对酪蛋白钠为117kJ/mol，酪蛋白钙为109kJ/mol。裂解发生可以有两种解释，其一是水解作用，生成丝氨酸残基（见表2-1反应3）；其二是β-消去，产生脱氢丙氨酸（见表2-1反应4）。β-消去在碱性溶液（如酪蛋白在0.1mol/L NaOH中，30℃）中确能发生。水解作用则在低pH值下较易发生。不管是发生哪一反应（或同时发生），分解反应的进程都可通过测定丝氨酸和脱氢丙氨酸而得知。有实验表明，κ-酪蛋白溶液在灭菌温度加热时慢慢失去其稳定酪蛋白胶束的能力。广义来说，κ-酪蛋白比β-酪蛋白热敏性高。

5.酪蛋白的去磷酸化

如上所述，酪蛋白去磷酸化后，热稳定性更好。加热后酪蛋白对Ca^2＋的稳定性也显著降低，这是由α_s-酪蛋白而不是κ-酪蛋白的酶促去磷酸化导致的。酪蛋白的去磷酸化在牛奶中的速度低于在酪蛋白酸钠中的速度：120℃，90min内有12%发生去磷酸化，120℃，30min内有18%发生。

酪蛋白酸钠和脱脂牛奶的加热去磷酸化在110～140℃时反应呈一级动力学，在pH6.0到pH7.0范围内与pH值无关；酪蛋白磷酸钠有117～121kJ/mol的活化能（与O-磷酸丝氨酸相同），脱脂牛奶有104.5～113kJ/mol活化能。浓度增加加快了去磷酸化反应速率，预热处理对未浓缩牛奶的去磷酸化速度无影响，但降低了浓缩乳的去磷酸化速度。α-酪蛋白和β-酪蛋白以同样的速度去磷酸化。因此可以预计去磷酸化对牛奶的热凝固有贡献，但这种贡献尚不能定量。

脱磷酸化和蛋白水解：酪蛋白磷酸键和肽键的水解缘于酶作用或热处理，早期的研究表明，酪蛋白钠在高温时的脱磷酸化快于酪蛋白，如120℃，20min的热处理后，牛奶损失丝氨酸磷酸盐10%，而酪蛋白钠则损失15%，反应呈一级反应，活化能104.5～121.2kJ/mol。Dalgleish等人（1987）报道经130℃，60min热处理后，酪蛋白磷酸盐的2/3被水解，丝氨酸磷酸盐连接胶体磷酸钙和酪蛋白，脱磷酸化意味着酪蛋白的解离。高温处理如135℃，60min使总氮量的10%～20%转化为非蛋白氮，巴氏杀菌或UHT杀菌时非蛋白氮变化很小。

6.酪蛋白在加热时的水解

加热处理中，使酪蛋白磷酸钠溶液中形成5%TCA可溶性氮的反应与时间呈线性，120℃5h后约有20%总氮可溶化。这一结果与大量的实验相一致，其中最详尽的是White和Davies，他们证明牛奶中10%～20%总蛋白氮在135℃，60min处理后转化为非蛋白氮（NPN）。NPN的形成与时间呈线性关系。Dalgleish等人（1987）报道130℃，60min热处理酪蛋白磷酸盐的2/3被水解。高温处理如135℃，60min使总氮量的10%～20%转化为非蛋白氮，巴氏杀菌或UHT杀菌时非蛋白氮变化很小。

加热可以明显改变酪蛋白在醋酸纤维上的电泳组分及在Sephadex和Bio-gel上的洗脱曲线。尽管140℃加热10min后，酪蛋白酸钠溶液中仍保留了一些降解产物，但含有5mol/L尿素的聚丙烯酰胺不能溶解其中的α_s-酪蛋白和β-酪蛋白。一种与凝乳酶水解酪蛋白时产生的巨肽有相同的化学和物理性质的肽类，在120℃加热20min时从整个酪蛋白或已分离的κ-酪蛋白中分离。加热产生12%的TCA可溶性硅铝酸的形成曲线基本与时间呈线性关系，20%～30%的κ-酪蛋白在热凝固点降解，结果与检验温度无关。

牛奶在加热过程中12%TCA可溶性肽和糖肽的释放已经详细研究过。糖肽在50℃或以上温度释放。除甘露糖以外，原连接在糖肽上的糖类由于热而释放，其数量少于凝乳糖肽上的数量，组成糖的相对数量随加热温度而变。由于热而释放的糖肽中糖类和氮的比例较低，糖肽中还含有主要位于由凝乳酶产生的副κ-酪蛋白中的D-甘露糖，这些表明了凝乳酶和热水解了不同的键或另外的键因热而被水解。

κ-酪蛋白稳定α_s-酪蛋白，防止因Ca^2＋而沉淀的能力，由于对分离的κ-酪蛋白进行相对温和的热处理（100℃，5min）而被减弱或破坏。在这个温度下，κ-酪蛋白的变化是非水解的，高度依赖于离子环境，并被认为是由于分子间的聚集产生的，其中可能包括二硫键、氢键和疏水键的反应。如果形成了一种可以稳定κ-酪蛋白不使其聚集的α_s-酪蛋白或κ-酪蛋白的复合物，就可以防止热导致κ-酪蛋白变性。而分离的κ-酪蛋白在90℃强烈聚合。

由κ-酪蛋白与胶束中的其他酪蛋白联合可以提供保护作用，因此κ-酪蛋白的热致聚集变化不可能是牛奶热稳定性的主要影响因素。但是κ-酪蛋白在更强烈的加热条件下的水解具有很重要的意义，特别是pH＞7.0时。不考虑检测温度，约有25%的κ-酪蛋白在热凝固点水解，说明这是热凝固的一个关键因素。

7.酪蛋白Zeta电位的变化

各种研究报道了酪蛋白胶束的不同的Zeta电位或表面电位，26℃和5℃时分别有8mV、26～51mV、-17.4mV、-26.8mV，6℃和30℃分别为44.5mV、-14.3mV、-19.6mV，20℃时-14.3mV。Hankinson和Palmer发现了Zeta电位和水解在胶束稳定性上的意义，现在广泛认为κ-酪蛋白的凝乳水解降低了胶束的Zeta电位，可能导致了通过范德华力产生的聚集。

高温加热使酪蛋白胶体的Zeta电位减小，这缘于加热过程中κ-酪蛋白的水解，α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白和β-酪蛋白的脱磷酸化，pH值的降低和磷酸钙的沉淀及美拉德反应等。也有多种文献报道经120～135℃的热处理Zeta电位的变化很小。在高温时无法测定，经冷却后热诱导变化的Zeta电位是否又可逆复原现尚未清楚。

通常认为在检测温度时不可能测定Zeta电位，但Darling和Dickson却认为这种变化不是随温度一致变化的，微小的增加或减少都可以被记录。如果牛奶的pH值在加热过程中降低，则说明在固定的pH值时Zeta电位实际是升高的。因此他们认为酪蛋白的热致凝固不是由于电荷中和而可能是由于疏水或范德华反应。不过他们只测试了三个样品，因此结果需要进一步的确认和延伸。

8.酪蛋白胶束的解离

关于剧烈热处理对酪蛋白胶束的影响（如导致聚集等），研究得较少，相当多的工作着眼于杀菌过程（特别是UHT过程中）的胶束变化。这些研究者都同意在杀菌和后继的贮藏过程中确实存在胶束的聚集，但在聚集的本质上存在分歧。有研究发现，当温度高于110℃时，酪蛋白胶束开始聚集。

已经证明，分散在经过90℃，30min加热的牛奶中的酪蛋白胶束是非沉淀酪蛋白（105000g，30min）。这说明分散是由于胶束中的钙被可溶性柠檬酸盐螯合，因为柠檬酸盐通常是被可溶性钙中和的，这些钙因加热过程中产生磷酸钙沉淀而变为“游离”。在高pH值的环境中，游离的柠檬酸盐溶解了胶态钙。

已经证实，在135～140℃加热15s到4min时，酪蛋白具有增溶性。κ-酪蛋白代表了40%左右的可溶性酪蛋白。同蛋白质的分子间反应一样，胶束钙的增溶作用也被认为与胶束解离相关。

Fox曾用黏度、超速离心和渗析色谱法研究过酪蛋白胶束在加热时的聚集-解离。在pH6.8时（热凝固时间HCT-pH曲线的最大点），黏度先上升然后下降直到开始聚集，黏度很快上升。在pH7.2（碱性最小值）时黏度-时间曲线上最大值和最小值更为明显。在热凝固时间HCT-pH的最小值时，起始黏度先增加直至聚集，但在一个相对较低的检测温度时，黏度-时间曲线的最大值-最小值仍然处于最小pH值范围内。

如此看来似乎是胶束先聚集后解离。聚集依赖于乳清蛋白，其曲线通常与酪蛋白胶束中游离蛋白在牛奶渗出液中的分散相近。但是如果降低Ca^2＋浓度，则不存在起始的黏度增加，而是基本保持不变直到聚集开始时再迅速增加。

以15000g离心牛奶或无血清蛋白酪蛋白胶束的悬浮液1h，可以沉淀近50%生奶中的酪蛋白。这表明两个系统中可沉淀的总氮百分数在140℃加热的早期阶段（1～5min）是增加的，但开始聚集后便下降了。可溶性氮加热时间曲线通常与黏度-加热时间曲线相似。

多孔玻璃的渗析色谱表明，在140℃加热的起始阶段酪蛋白胶束的峰值是增加的，但若进一步加热则开始下降。较显著的胶束解离显然是从140℃，20min后开始的（只先于可见的聚集），此时大约有50%的总蛋白质在可溶性蛋白质的峰中被洗脱。

9.酪蛋白胶束的水合

Fox等人（1981）发现，pH6.8，140℃，15min的热处理减少了酪蛋白的水合作用。Ruegg等人（1979）发现加热乳中酪蛋白胶体的平衡水含量明显低于未加热乳中酪蛋白胶体的平衡水含量，这预示着加热减少了酪蛋白胶体的水合作用。Creamer和Matheson的研究表明，随着pH值的下降，胶体的水合作用也下降，若pH值下降发生在热处理过程中，则热处理对酪蛋白胶体水合作用没有实质性影响。已有一些研究着眼于HCT和酪蛋白的关系，但这种关系尚无定论。

胶束水合与Zeta电位的变化有密切的依赖关系。加热过程中酪蛋白水合的变化尚未有报道。可以通过以下方法制备水合胶束：将140℃加热0min、1min、2min、5min、10min、15min后的乳超速离心（90000g），起始pH6.8。结果发现水合作用确实有下降，这与已报道的Zeta电位的变化不一致。Zeta电位、加热时的水合作用及其影响因素都需要更详细的研究。

（二）乳清蛋白的变化

牛乳经热处理后，其外观发生的种种变化，不同程度地与蛋白质特别是乳清蛋白的热变性有关。牛乳经高温加热后，由于乳清蛋白变性而使黏度增大，影响稀奶油的分离。而经63℃，30min的低温保持杀菌后立即冷却的牛乳无此现象。乳清蛋白不含磷，脯氨酸含量低（占总乳清蛋白的5.2%），而胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸含量较高，这些都导致乳清蛋白对热非常敏感，热变性程度是温度和时间的函数。巴氏消毒乳的乳清蛋白变性比例达到10%～20%，间接加热式UHT乳达70%～80%，直接加热式UHT乳为40%～60%。

1.乳清蛋白的变性温度

乳清蛋白的热稳定性总体而言低于酪蛋白，相对地说，其中α-乳白蛋白的热稳定性最高，β-乳球蛋白及血清白蛋白次之，免疫球蛋白最低。加热30min时，它们的变性温度分别是：免疫球蛋白70℃，血清白蛋白74℃，β-乳球蛋白90℃，α-乳白蛋白96℃。在此温度、时间内，䏡、胨组分不变性。

2.热处理对乳清蛋白的影响

脱脂乳中乳清蛋白的热变性可见图2-1，从图中可以看出与一定的温度及时间相对应的乳清蛋白热变性的百分比，在此范围内热变性的程度随温度的上升而有规律地增大。

牛奶加热时发生可逆的酪蛋白缔合及蛋白质构形的变化，如β-乳球蛋白二聚体与其单体的转化。大多数乳清蛋白的溶解性因热变性而下降，温度高于60℃时尤为明显，乳清蛋白会与酪蛋白缔合，但如前所述，不同的乳清蛋白具有不同的敏感性。免疫球蛋白失活时，同时也失去对细菌和脂肪球的冷凝集反应的抑制作用，这可能是加热变性的缘故。

与酪蛋白相比，乳清蛋白相对热不稳定，77.5℃加热60min，80℃，30min或90℃，5min就彻底变性。在分离蛋白的溶液或乳清中，热变性的乳清蛋白聚集沉淀的程度依赖于温度、pH值和Ca^2＋浓度。但是变性的乳清蛋白在牛奶中并不直接沉淀而是在酸化、盐析或超速离心时和酪蛋白共沉淀。变性乳清蛋白对沉淀的保护作用似乎是非特异性的，受所有酪蛋白组分影响，这可能与酪蛋白隐蔽了Ca^2＋有关。通常可以接受的是当共同加热或将κ-酪蛋白加入预热的β-乳球蛋白中时，它们通过巯基-二硫键相互变换反应。不太确定的是这样的复合物是否是在加热中形成的，这种复合物的分离状态和复合体系中是否相似。毫无疑问，加热牛奶时β-乳球蛋白和酪蛋白之间存在一些反应，这些反应显著影响了牛奶的热稳定性和凝乳酶聚集。提高pH值后的变性的乳清蛋白-酪蛋白胶束复合物发生解离，这可能与HCT-pH曲线上的最大值-最小值现象有关。

基本上所有关于β-乳球蛋白和κ-酪蛋白反应的研究都在80℃和90℃进行。目前没有明确的证据说明β-乳球蛋白-α-酪蛋白复合物甚至在110℃或140℃也可以形成，这种观点尚未得到证实。

尽管已有报道说在加热过程中α-乳白蛋白和κ-酪蛋白不发生相互反应，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白确实发生反应，但这种复合物表现出与κ-酪蛋白的反应。Rose报道α-乳白蛋白不改变酪蛋白胶束悬浮液的HCT-pH曲线，但Fox和Hearn报道，对此α-乳白蛋白具有和β-乳球蛋白相同的效果。

采用聚丙烯酰胺圆盘电泳研究加热对牛奶蛋白质的影响。根据迁移率降低的顺序可将乳清蛋白带分类，其中包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白（SA）和免疫球蛋白。将κ-酪蛋白和β-乳球蛋白分散在含有乳中正常矿物质的溶液中加热至74.5℃保持30min，发现两者发生了络合；将其加热至85℃时反应彻底进行。若将α-乳白蛋白或牛血清白蛋白（BSA）与κ-酪蛋白一起在同样条件下加热则不会发生反应。将β-乳球蛋白A和B在74.5℃或85℃保持30min，将出现一条共有的电泳带，它的电泳迁移率较慢，这也许是因为在加热过程中分子大小增加了或分子构形发生了变化。这种蛋白质在天然乳清中并不存在。

3.热处理对乳球蛋白的影响

乳清蛋白的加热变化直接或间接地与硫化氢的发生、加热异味的生成、抗氧化性的发生等现象有关。β-乳球蛋白的量接近乳清蛋白总量的一半，而且β-乳球蛋白加热后又容易发生变化，因此β-乳球蛋白的变化对乳制品有很大的影响。

β-乳球蛋白在30℃以下的牛乳中是以二聚体的形态存在的，在30℃以上则解离成单体的形态。在65℃以上加热时，由于凝聚而使相对分子质量增大，随后电泳迁移率增加。进而在85℃以上加热时，—S—S—键裂解，产生游离巯基，甚至产生挥发性的硫化物和硫化氢。图2-2表示了β-乳球蛋白加热变性的过程。

有人采用色谱法对加热导致的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的反应进行研究。通过实验和计算发现，当单独加热β-乳球蛋白时，这种蛋白质的减少为14%；而加热乳清蛋白时β-乳球蛋白的减少为36%，当一起加热α-乳白蛋白和β-乳球蛋白时，减少值为84%。这说明当这两种蛋白质一起加热时，β-乳球蛋白改变了α-乳白蛋白的色谱性质。Sawyer等建议β-乳球蛋白和κ-酪蛋白的复合物是通过双硫键连接的。

4.巯基的变化

蛋白质半胱氨酸上的巯基具有弱酸性，当温度上升时极易解离。如表2-1所示，巯基可参与许多反应，游离巯基存在于β-乳球蛋白、乳清蛋白和脱脂球膜蛋白、二硫化物、α-乳白蛋白和免疫球蛋白中。每摩尔κ-酪蛋白中含2个半胱氨酸，α_s2-酪蛋白同样含有2个半胱氨酸。研究表明在β-乳球蛋白中存在如下平衡：二硫化物Cys106-Cys119，Cys106-Cys121，巯基Cys119与Cys121。加热温度大于60℃，巯基暴露、活化并易于与许多试剂发生反应，这种活化巯基有时被称为自由巯基。蛋白质的巯基释放，作为蛋白质变性的重要指数之一已得到较深入的研究。

由于β-乳球蛋白热变性产生活性巯基，特别是产生硫化物和硫化氢，给牛乳带来了蒸煮气味（cooked flavor）。一般对牛乳的热处理程度越高，则牛乳风味的恶化也越显著。除了β-乳球蛋白是活性巯基的主要来源外，脂肪球膜蛋白加热后也能产生部分活性巯基。脱脂乳中的巯基量与加热温度、时间的关系见图2-3。

活性巯基是强有力的还原剂，因此加热后的牛乳的氧化还原电势降低，并产生了抗氧化性。热处理引起的牛乳的抗氧化性是有利的，在生产中应适当掌握，充分利用有利因素，尽量避免不利影响，从而可以提高乳制品的保藏性。

在空气存在条件下加热，部分自由巯基会氧化成二硫化物，温度从60℃（20min）上升到125℃（20min）能加速该转化过程。我们知道，牛乳中含巯基氧化酶，它能将巯基氧化成二硫化物。半胱氨酸残基经氧化成二硫化物后，还能继续氧化成磺基丙氨酸。至今仍未阐明牛乳蛋白质加热过程除氧化生成二硫化物之外，是否进一步氧化。二硫化物可以在分子内或分子间形成，分子间形成二硫化物组成一聚合物。如表2-1中反应6所示，聚合也可来自二硫化物的相互交换反应，这一点已在β-乳球蛋白加热至70℃得到证实。热变性β-乳球蛋白易与κ-酪蛋白反应。

如表2-1反应8所示，牛乳加热过程发生半胱氨酸巯基裂解（β-消去），生成脱氢丙氨酸的反应。β-乳球蛋白在pH6.9，97℃加热80min后，每摩尔蛋白质产生约0.15mol脱氢丙氨酸，相当于15%的半胱氨酸残基；在同样的温度时间条件，pH9.8的情况下，半数半胱氨酸发生裂解。有证据表明β-消去仅发生在巯基氧化成二硫化物之后。

牛乳加热过程中释放的挥发性硫化物（主要是硫化氢）通常被认为是牛乳蒸煮味的来源。毫无疑问，它产生于（或部分产生于）脂肪球膜蛋白或β-乳球蛋白的半胱氨酸残基的β-消去反应。不同乳制品加热时，挥发性硫化物的生成量不同，稀奶油高于脱脂乳，每升牛乳中富含β-乳球蛋白约3.2g，脂肪球膜蛋白的半胱氨酸残基则要少得多，因此释放时挥发性硫仅为总巯基和二硫化物的一小部分。

当温度超过75℃，乳蛋白（主要是β-乳球蛋白）的Cys和Met两种含硫氨基酸巯基被裂解，生成H₂S、硫醇和硫化物等，使得牛乳产生了蒸煮味。热处理产生的HS—浓度和蒸煮味的程度主要与加热温度、热变性的深度有关，90℃时达到最大值。随着加热温度升高和时间延长，牛乳中的Cys和Met含量会有轻微下降，经测定UHT乳中HS—的浓度是0.7μmol/L，间接加热杀菌比直接加热杀菌的蒸煮味更严重；巴氏消毒牛乳通常没有蒸煮味。几天后自由巯基因被氧化而含量下降，所以蒸煮味也变淡，这就是UHT牛乳放置15d左右风味达到最佳的原因。为了减少蒸煮味，可以在UHT乳中添加L-Cys，这样可以降低巯基浓度；也可在牛乳中添加巯基氧化酶。

如表2-1反应9所示，巯基还可能与脱氢丙氨酸残基反应形成羊毛硫氨酸铰链，但分析表明，对1%β-乳球蛋白的溶液，pH6.9，97℃下加热80min，仅有少量羊毛硫氨酸生成。然而115℃，27h加热1g“干”乳清蛋白和115℃，54h加热同样质量的“干”乳清蛋白可分别产生2.7mg和12.0mg的羊毛硫氨酸。

（三）酪蛋白和乳清蛋白的相互作用

我们知道90℃的热处理使乳清蛋白变性并和酪蛋白聚合，这种结合的程度和类型依赖热处理的程度，所发生的反应包括κ-酪蛋白的参与及二硫键互换反应的发生。

在β-乳球蛋白缺乏的情况下，α-乳白蛋白很难在加热过程中和酪蛋白胶束结合。变性乳清蛋白在90～140℃、pH＜6.7的乳中络合于胶体表面，包括络合于κ-酪蛋白上，在较高的pH值如pH7.3时加热，乳清蛋白不和酪蛋白结合，胶束大部分解离。浓缩乳清蛋白和酪蛋白胶束的结合少于非浓缩乳。pH6.55、120℃加热后50%的乳清蛋白还将留在乳清中，当pH6.85时则上升为75%，乳清相中的乳清蛋白通过二硫键和κ-酪蛋白形成络合物。

一般认为，当共同加热或将κ-酪蛋白加入预热的β-乳球蛋白中时，它们通过巯基-二硫键相互变换反应。但还不能确定，这样的复合物是否是在加热中形成的，这种复合物的分离状态和复合体系中是否相似。毫无疑问，加热牛奶时β-乳球蛋白和酪蛋白之间存在一些反应，这些反应显著影响了牛奶的热稳定性和凝乳酶凝集。

β-乳球蛋白和α-乳白蛋白改变酪蛋白盐体系的热稳定性的机制尚未建立。开始认为β-乳球蛋白有稳定作用，但有一些人认为，在pH6.9时β-乳球蛋白使酪蛋白不稳定，因此HCT-pH曲线上有最大值-最小值。β-乳球蛋白对酪蛋白热稳定性的影响依赖于磷酸钙的浓度，这也许是因为β-乳球蛋白-酪蛋白复合物中钙沉淀，与分离的β-乳球蛋白的情况类似。

牛乳加热到70℃以上时，β-乳球蛋白易与κ-酪蛋白和α_s2-酪蛋白反应，然后与酪蛋白胶束结合。pH值大于6.6时，β-乳球蛋白与非胶束型酪蛋白部分结合，随pH值升高，结合变小，pH值大于7.0时，实际上已不存在结合。α-乳白蛋白、乳清蛋白、免疫球蛋白也与酪蛋白结合，上述反应能明显影响酪蛋白胶束的特性；若牛乳热处理中酪蛋白发生沉淀（如在等电点附近），则正常情况下沉淀中还包含有热变性乳清蛋白，这一特性已被用来评价牛乳热处理程度。当加热乳清蛋白时，变性乳清蛋白在一定程度上发生聚集，pH6.6以上，聚集较少；低pH值情况下，它们的稳定性下降，pH4.5附近时，下降到最小值。提高pH值后（pH6.8）变性的乳清蛋白-酪蛋白胶束复合物表现出解离，这可能与HCT-pH曲线上的最大值-最小值现象有关。

在加热过程中α-乳白蛋白和κ-酪蛋白不发生相互反应，而是与β-乳球蛋白反应，并且这种复合物可以与κ-酪蛋白反应。对于α-乳白蛋白是否改变酪蛋白胶束悬浮液的HCT-pH曲线的问题，有不同的看法，尚无定论。

（四）牛乳蛋白质热变性对牛乳的影响

牛乳受热变性对牛乳质量的影响不一定就是负面的，具体的影响可以总结如下。

1.易于消化

实验发现，胰蛋白酶、胃蛋白酶和胰液素更容易黏附在变性蛋白上。牛乳蛋白质经热变性后结构变得松散，所以变性牛乳容易被酶降解，比天然牛乳更易消化，UHT灭菌和巴氏消毒乳蛋白质比生奶更有利用价值。只有强烈的热处理（120℃、60min）能减少胰蛋白酶的水解能力，但能大大提高胃蛋白酶的水解率。另外，热变性蛋白质在胃内被胃酸水解后形成的颗粒分散能力非常好，这也有利于酶的黏附、降解。热处理会灭活胰蛋白酶抑制剂，反过来就能促进胰蛋白酶的活性，这也能促进乳蛋白的降解和消化。

婴幼儿饮用UHT乳后出现消化不良的比例很少，主要也是因为牛乳的热变性蛋白在胃酸作用下特别容易分散。当牛乳的受热强度达到120℃、80min时会影响乳蛋白的消化性，但这种加热强度在乳品加工中几乎不会出现。

2.不利影响

即使是UHT杀菌，乳蛋白性质变化也几乎不会影响它的生物价值，实验发现小老鼠在利用UHT乳、巴氏消毒牛乳和灭菌乳的蛋白质方面几乎没有差别。UHT乳的蛋白质平均得率（老鼠体内氮占体重的比例增加与膳食氮的摄入量之间的关系）与生乳的相同，都是96%～97%。如果测定氨基酸的生理活性，可以发现UHT乳中活性是生乳的95%～100%。婴幼儿的膳食实验证明，不同杀菌工艺的牛乳对它们营养没有显著差异。只有当使用极端热处理能改变牛乳蛋白质的生物活性，但在牛乳加工时从来不需要使用这些极端热处理。

碱性添加下对牛乳加热，乳蛋白会发生化学变化，形成赖氨酸-丙氨酸（lysinoalanine，LAL），将赖氨酸由L型转化为D型。当老鼠食用含2000mg/kg结合蛋白质的LAL食物，它们的肾将会受到伤害，产生肾细胞肿大吞噬作用（nephromegalocytosis）；而LAL对小老鼠的毒性很低，对猴子等其他动物甚至没有毒性。因此可以推测LAL对人体没有毒性，所以即使在家庭饮食中摄入了LAL也不会对人体产生任何毒副作用。当膳食中含20%的碱处理大豆蛋白，老鼠就会患肾细胞肿大吞噬作用；而当改用碱处理乳白蛋白，即使LAL含量再高老鼠也只是患轻微的肾细胞肿大吞噬作用。若将8%～10%未处理乳白蛋白加到含10%～12%经碱处理的大豆蛋白或乳清蛋白中，老鼠食用含1800～2500mg/kg的LAL也不会引起肾细胞肿大吞噬作用和骨细胞吞噬作用（cariomegalocytosis）。

牛乳和牛乳制品、婴儿食品都不含LAL或含量极少，只有加工时的热处理强度过高时才会引起LAL含量偏高。酪蛋白酸和碱处理产生的酪蛋白-乳清蛋白聚合沉淀物都与LAL含量有关，但控制加工过程中的温度和pH值等参数能减少LAL生成量。虽然LAL自身对人体没有毒副作用，但由于赖氨酸的ε-NH^＋₃（即6碳位的-NH^＋₃）参与它的形成反应，所以会导致蛋白质变性；同时发现Cys和Ser含量下降、蛋白质水解速度减缓。所以LAL的升高是蛋白质受热损失的重要指标。

二、乳其他成分的变化

（一）加热时乳脂肪的变化

乳脂肪的97%～98%是甘油三酯，决定乳脂肪的主要理化性质，其他组分还包括二甘酯、单甘酯、自由脂肪酸、自由固醇和磷脂等。加热时脂肪球发生冷凝集、脂肪结晶、磷酸酯（尤其是酪蛋白磷酸酯）的水解等。部分有机磷酸酯甚至磷脂在高温下（100℃以上）也会发生分解。温度高于60℃时，形成游离巯基和硫氢化合物。脂肪球膜发生变化，如钙含量的上升等。甘油三酯在高温（120℃以上）时进行酯交换反应，该反应受二甘酯、单甘酯的存在情况的影响；该温度条件下，一些极性脂肪也发生反应。加热还形成了一些来源于脂肪的内酯和甲基酮的形成。牛乳经加热后游离脂肪酸减少。据报道，游离脂肪酸加热后的平均损失量是72.8℃，16s为13.1%；62.8℃，30min是15.6%；85℃，30min达24.4%。

总体而言，乳制品工业上使用的杀菌对牛乳的脂肪没有不利影响，脂肪和油经过高温加热不会对健康有害，这是因为温度对脂肪的光化学氧化影响甚微。高温下牛乳中会形成过氧化物、过氧化氢物、羰基化合物和羟基脂肪酸的物质，而且如果有空气存在会加速不饱和脂肪酸和胆固醇的过氧化反应，但这些产物对健康没有不利影响。只有极端加热（200℃、20h）才会产生对人体有害的聚合产物，但这种加热强度在乳制品加工中不会出现。

牛乳受热后羟基酸会转化为内酯，后者会影响牛乳的感官特性。内酯存在于所有加过热的牛乳和乳制品中，有时它们的含量非常低，对产品的风味只有轻微的影响。另外，牛乳受热后还能形成乙醛和甲基酮等羰基化合物，它们也会影响牛乳的风味。UHT牛乳比巴氏消毒牛乳含的内酯和羰基化合物更多，例如，甲基酮占脂肪的含量在生鲜牛乳、巴氏消毒牛乳和UHT牛乳中分别是10nmol/g、12nmol/g和21nmol/g，而在传统杀菌方法加工的牛乳中更是高达104nmol/g。

多数不饱和脂肪酸和亚油酸等必需脂肪酸（essential fatty acid，EFA）在高温下性质稳定，例如只有在180℃下保温1h才能测到亚油酸的降解产物，至今尚没有在UHT牛乳和灭菌乳发现必需脂肪酸的降解产物。高温会引起磷脂变化，会增加自由脂肪酸含量。

高温会抑制脂肪的自发氧化。脂肪酸及其残基的双键有可能被氧化，有的氧化产物会影响产品的风味，如产生油腻、腥味、金属味和木屑味等异味。

能极大促进乳脂肪自发氧化能力的几种试剂是游离O₂、超氧自由基（O^－₂·）和羟基（OH·）。

①Cu能促进O₂的产生，而巴氏消毒能刺激—SH特别是自由H₂S的生成，后者与Cu^2＋结合形成CuS沉淀；

②Maillard反应产物是抗氧化剂；

③加热可以破坏超氧化物歧化酶（EC 1.15.1.1） （一种强抗氧化剂，又称SOD）的活性；

④中温加热能促进脂肪的自发氧化，这有可能是因为Cu增加。

UHT牛乳在保存过程中，脂肪会发生自发氧化反应，而且这种反应随着牛乳中溶解氧的增加、贮存温度升高而加剧，这种氧化作用会破坏牛乳风味。Dunkley和Franke发现牛乳贮存温度由0℃到4℃，再到8℃，牛乳的风味在减弱，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）含量下降。

（二）加热时乳中糖类的变化

通常牛乳在热处理过程中，其所含的乳糖成分并不会有太大的改变。但是强烈的加热处理，则会造成乳糖的分解，尤其以浓缩乳最为明显。乳糖加热后发生了一系列变化，生成有机酸（主要是甲酸）和乳果糖等，上述变化在温度高于100℃尤为明显。牛乳在加热过程中，酸形成的速度随牛乳中乳糖含量的增加而呈比例地增加。所形成的酸类包括甲酸、乳酸、丙酮酸、丙酸、丁酸等。

牛乳因加热所导致的乳糖分解产生的化合物包括甲基二醛、丙酸醇、落叶松皮素、5-羟基-2-甲基糖醛及糖醇等。

（三）加热时乳中维生素的变化

牛乳经加热后，其营养价值因维生素的损失而降低。表2-2为各种热处理对维生素损失的影响。

从表2-2中可以看出，维生素A、维生素B₂、维生素D、尼克酸及生物素对热是稳定的，在一般加热处理中不会受到多少损失。维生素B₁、维生素B₁₂、维生素C等在加热处理中会受到损失，但是在无氧条件下加热，就能减少其损失。

1.维生素A

由于维生素A是脂溶性的，脂肪对它有保护作用，全脂牛乳加热和保存过程中它基本是稳定的，但脱脂牛乳（0.04%脂肪）经UHT杀菌可以造成40%的损失。含脂率为0.5%的牛乳在5℃保存3个月，而含脂率为0.15%的牛乳在26℃保存8d（Lau，1986），维生素A的损失都是50%。

此外，不同包装容量对维生素A的影响也有差异，含脂率2%巧克力牛乳在20℃保存28周后，1L纸盒包装的维生素A损失36%，而250mL包装的损失25%。Gaylord（1986）发现提高牛乳的非脂乳固体也能减少维生素A的损失。

低脂牛乳（2%脂肪）和全脂牛乳经光照后保存在4℃环境，维生素A损失呈一级反应。Murphy等测定了7～10℃时脱脂牛乳中维生素A在玻璃、塑料或纸盒和暴露在荧光中的降解速度，发现降解50%所需时间分别是41h、61h和1004h。

2.维生素C

牛乳的维生素C基本不能起到营养作用，但能保护叶酸。所有研究都证明无论是加热还是贮存，牛乳的维生素C都损失严重，这一方面是由于加热会导致维生素C损失；另一方面在保存过程中由于O₂的存在导致维生素C被氧化脱氢，而且牛乳初始O₂含量越高，维生素C损失越严重。加热对牛乳进行脱气，可将O₂的含量降至0.05%，这样牛乳中的维生素C在前两周下降很快，然后就非常缓慢。牛乳贮存在隔绝空气的塑料或涂蜡纸盒，维生素C的损失速度将比贮存在玻璃的更快。

Nagy（1980）的研究表明贮存温度越高，维生素C损失速度越快。

3.叶酸

Thomas等（1975）的研究表明氧气含量适中（5.2×10^-6）或较低（1×10^-6）时，叶酸在热加工过程中的损失很少；若氧气含量达到8.4×10^-6，叶酸将损失18%；如果继续在23℃的黑暗环境中贮存28d，叶酸的含量将快速降至6%以下。

三、乳pH值的变化

牛乳加热后，滴定酸度上升，pH值下降。滴定酸度的上升是众多因素综合作用的结果，但主要来源还是乳糖分解产酸。

在较高温度的热处理时，pH值从6.7开始下降，直至凝集时的pH值为5.5～6.0。下列因素分别对pH值下降贡献了30%、20%和50%：①由于H^＋释放使pH值下降，这是由于CaHPO₄、Ca（H₂PO₄）₂会形成Ca₃（PO₄）₂沉淀而导致H^＋的释放；②有机磷酸酯键（酪蛋白中）水解和磷酸钙的沉淀；③乳糖热断裂形成甲酸等有机酸。

图2-4显示了乳的热凝固时间依赖于pH值的实例，它表明在不同的pH值下决定凝集速度的是不同的反应，也显示出不同的乳对pH值的依赖性不同。绝大部分的牛乳是A型，一些是B型。混合乳一般为A型，但其曲线的形状会显示出比图2-4所示的更多的变化。

图2-4所示的pH值是加热前室温下pH值的实例，在高温下pH值将会低得多。但这主要是水的离解增加的结果，并且较低pH值并非意味着更酸的环境。在高温下无定形的三磷酸钙沉淀，及由此引起的质子释放，可促使pH值进一步降低，更进一步地在加热过程中产生酸。凝固时的pH值（在室温下测定）将大大降低，pH值越低，凝固所需的时间越长，温度要求也越高。pH值变化速度依赖于最初pH值和O₂的变化。因乳糖产酸需要O₂，加热过程中酸的产生速度在乳（非浓缩乳）的热凝固中是一个非常重要的因素。凝固时的pH值总是低的（＜6.2，于室温下测定）。加热过程中加入碱，维持其最初pH值，可防止热凝固，这种效果甚至可以在加热后维持几小时。热凝固的表观活化能通常与产酸活化能相等。

四、褐变反应

牛乳经长时间高温加热则发生褐变反应。这类反应属于非酶褐变，主要是酪蛋白的末端氨基酸——赖氨酸的游离氨基与乳糖的羰基发生反应（美拉德反应，Maillard），其次是乳糖的焦糖化反应。该反应涉及酸、碱催化的烯醇化反应和脱水反应。美拉德反应中糖的降解途径与焦糖化过程很相似，所不同的是美拉德反应中加热温度更温和，pH值接近中性。美拉德反应途径在乳与乳制品中是最重要的反应之一。

美拉德反应低温下也能进行，但温度升高，美拉德反应加速。加热牛乳时，一开始颜色变白，随后随加热温度的上升，逐渐产生褐色。牛奶加热过程中首先出现“蒸煮味”，主要来自巯基和硫氢化合物；而后出现的杀菌牛乳的风味，是美拉德反应及其他反应的结果。牛乳的酸度也影响美拉德反应的发生，褐变的临界pH值为6.0～7.6。另外，牛乳中微量尿素的存在也被认为是反应的重要原因。

乳糖在高温下焦糖化而形成的褐变，其反应的程度随温度和酸度而异，温度与pH值越高，褐变越严重。此外，糖的还原性越强，褐变也越严重。因此，使用转化糖含量多的蔗糖或混用多量葡萄糖时，会产生严重的褐变。

褐变反应可以被硫氢基、亚硫酸氢钠、二氧化硫、甲醛或添加0.01%游离半胱氨酸所抑制。在实际应用中，褐变反应可利用减少加热处理过程的时间和温度、减少干燥制品的水分含量及控制制品的贮存温度及时间等方法来防止。

美拉德反应中，实际上真正的褐变发生之前，产品风味已受到严重影响，因此研究美拉德反应的前一阶段（褐色产生之前）具有非常重要的意义。乳制品褐变反应的证实或反应进程的监测可从以下几个方面入手：反应产物、褐色素、荧光强度、异味、pH≤6.5时测得的还原能力以及赖氨酸减少量。美拉德反应的许多化合物已得到分离与鉴定，如5-羟甲基糠醛、糠醛、麦芽酚、丙酮醇、2-酮基丙醛、乙醛和甲酸、乙酸、丙酸、丁酸以及乳酸。

5-羟甲基糠醛可通过比色反应测定，已被用于监测美拉德反应的一系列过程，麦芽醛及其他化合物对乳制品的风味有贡献。除某些特殊需要外，大多数乳制品中不希望出现褐色。褐变程度可通过测定产物的反射比得到，部分产物吸收紫外线，反射荧光，这些物质可用醚予以抽提，因此它区别于核黄素。

乳制品美拉德反应主要受pH值、时间、温度和水分活度的影响。在一定范围内随pH值上升，褐变反应加速，但由于反应中有酸生成，因此在一定程度上还有自我抑制作用。褐变反应速率随固形物浓度的增加而增加，当水分活度达到0.6时，达到最大值。单糖比双糖更易与氨基化合物反应，因此乳糖经乳糖酶水解后更易于褐变反应的发生。

现在研究较多的褐变反应多是发生在pH值上限的140℃以上的褐变。图2-5显示的是牛奶在pH6.7和pH7.2时加热到140℃染色力的下降，这可假定它反映了与乳糖反应后赖氨酸的未利用率。在pH6.7和pH7.2加热20min后，分别有接近15%和25%的赖氨酸残基表现为不能利用。蛋白质赖氨酰残基的ε-氨基参与羰基的美拉德反应，它也能与脱氢丙氨酸和羧基侧链形成“铰链”（如表2-1反应10、11、12）。这些反应仅在激烈的加热条件下方能发生。在112℃下加热“干”酪蛋白或乳清蛋白还可产生异肽、ε-N（β-天门冬氨酸）赖氨酸和ε-N（γ-谷氨酰基）赖氨酸。碱性条件下加热还能生成赖氨酰丙氨酸。牛乳杀菌（包括UHT）过程中，每千克蛋白质可产生100～500mg赖氨酰丙氨酸，某些蛋白制品或衍生产品中赖氨酰丙氨酸的含量更高，这一点已引起专家的注意，因为高剂量的赖氨酰丙氨酸对鼠试验具有毒性，但同样的剂量对人体却基本上不会产生有害影响。

赖氨酸的ε-末端似乎与一些牛奶的聚集反应有关：赖氨酸的变性阻止了凝乳聚集的二级阶段；乙醛延长了HCT的原因可能是通过与赖氨酸的反应；褐变反应与UHT牛奶的老化胶凝有关。因此可以认为在热稳定性中美拉德反应有一定作用。但对一个添加了5%的乳糖的样品与添加了5%蔗糖的无乳糖牛奶样品，在加热后分离酪蛋白的钙敏感性没有显著不同。

向牛奶中添加尿素而促进褐变反应，其原因可能是尿素和乳糖的反应或它们产物的降解导致的。这样尿素可能对蛋白质的氨基有保护作用，但是这种保护作用并不在尿素对牛奶的稳定作用中起显著作用。

加热会使酶的结构发生变化，造成酶活性丧失。一般而言，温度高于50℃时酶开始钝化，但是不同的酶的钝化温度不同。解脂酶经80～85℃的高温短时间或超高温处理失活。磷酸酶经62.8℃，30min或72℃，15s加热后会钝化，可用这个性质来检验低温巴氏杀菌法对杀菌牛乳的杀菌处理是否充分。过氧化氢酶经75℃，25min加热可全部钝化。过氧化氢酶的钝化温度和时间为70℃，150min；75℃，25min和80℃，2.5s。

五、无机物的影响

乳的热处理减少了可溶性磷酸盐、可溶性钙、离子钙的量，其程度依赖于热处理的时间和温度。如在60～83℃加热时，可溶性钙减少0.4%～9.8%，可溶性磷减少0.8%～9.5%。这是由于可溶性的钙和磷形成Ca₃（PO₄）₂沉淀。溶解钙和磷酸盐结合为胶体磷酸钙沉淀，也可通过和酪蛋白胶束的结合防止其沉淀。若加热温度＜110℃，这些沉淀物会重新溶解；若加热温度＞110℃，这种变化是不可逆的。加热对单价离子如Na^＋、K^＋、Cl^－没有影响，对柠檬酸盐的影响尚不清楚。

利用一个中空纤维超滤与不锈钢热交换器结合的方法在不同温度下制取牛奶渗透物。牛奶样品先调至4℃，然后在超滤前分别加热到20℃、40℃、60℃、80℃、85℃或90℃。测定渗透物样品中Ca、P、Mg、Na、K和柠檬酸根的浓度。结果发现当温度升高时，Ca和P的含量下降，Mg和柠檬酸根含量也略有下降，而Na和K的含量没有受到影响。在本研究中获得了一个时间-浓度关系图（图2-6和图2-7）。

在保温的开始阶段浓度有一个明显下降，然后反应较为缓慢。加热过程中伴随着磷酸二钙和磷酸三钙的沉淀。

把渗透物冷却到室温后测定pH值，获得pH曲线。pH曲线和Ca、P曲线的相似性表明磷酸钙沉淀是加热的牛奶pH值下降的主要原因。根据Pyne报道，磷酸钙沉淀变化是在适度加热的牛奶中唯一发现的可意识到的盐平衡变化，尽管当温度上升时与酪蛋白结合的钙的变化可能导致pH值的下降，柠檬酸钙沉淀也将导致一定程度上的pH值下降。

关于柠檬酸盐沉淀的研究尚存在不同意见。Evenhuis和De Vries（1957）、Davies和White（1959）等人的研究都不以此温度下的渗透物和透析物为样品进行，这可能导致了一些反向的柠檬酸钙沉淀发生。Boulet和Marier报道说室温下的脱脂牛奶被柠檬酸钙饱和，但提高温度并不能使这种盐沉淀。在这种情况下我们必须考虑到他们关于95℃下柠檬酸钙的溶解性计算时所用的是室温下的解离常数。Lyster（1979）关于牛奶中离子平衡的计算也表明40℃下pH4.6和pH6.5时可能存在柠檬酸钙沉淀。Pouliot等人的研究也表明当将一个20℃时pH7.0、离子强度0.8的柠檬酸钙的饱和溶液加热到95℃时也发生沉淀。

关于无定形的磷酸钙或三聚磷酸钙具有热致沉淀的假设并不能根据现在对于沉淀物质中Ca/P比率的研究加以证实。这个比率约为1.0，与加热导致二聚磷酸钙沉淀的比率一致。但在实验中，时间-Ca、P浓度变化的曲线不是一个典型的成核过程，并没有促进二聚磷酸钙的沉淀。根据在室温下的其他研究发现，二聚磷酸钙的典型成核过程只存在于牛奶的渗透液中而不是在起始的牛奶中。Edmondson（1956）等人发现只有在88℃加热牛奶15min之前加入Na₂HPO₄才产生二聚磷酸钙的沉淀。还不清楚沉淀是由胶束态的组分独立发生还是由胶束态的磷酸钙结构直接变为新的沉淀组分。Holt（1982）已经指出，室温下牛奶渗透液对于二聚磷酸盐而言是饱和的。因此认为沉淀可能是由于温度升高。

Pouliot等（1989）认为热致盐类变化是一种典型的二级变化。如果认为Ca、P、Mg和pH值在开始发生沉淀的最初时间内发生第一次沉淀，则二级反应还包括更慢的反应，并与温度无关。

但是必须考虑到所谓的二级反应可能是由于一级反应达到其平衡点后而变缓慢导致的。柠檬酸盐在整个过程中的变化表明这是一个相对较慢的过程。因此，这种缓慢的可逆的起始柠檬酸盐沉淀可能是起始pH值和Ca降低的直接结果，它增加了柠檬酸盐沉淀的溶解性。柠檬酸盐的反向也因P的反向而滞后，这说明在两个钙盐和它们的反向之间的反应应该是一个再平衡的过程。Rose和Tessier（1959）的研究也提出在加热的牛奶中存在盐类的二级沉淀。他们发现在加热的起始5min内存在可溶性盐类的降低，在接下来的20min内只有很小的变化。

事实上，第二步反应与热致磷酸钙沉淀反向转化为Ca/P比率更高的更偏碱性盐相关，这样也解释了在保温时间为30～120min内P的微小变化。Boulet（1960）建立了一种模型体系来证明磷酸钙沉淀以两步进行，包括一个较快的凝胶化的沉淀以及后继的由更偏碱性的组分形成粒状盐而导致的诱导过程。这表明粒状沉淀的形成是由于二聚磷酸钙快速反向转化为更碱性成分而导致的。Schmidt和Both（1987）的研究证实若一个适度超饱和溶液50℃时pH＞6.14，其中二聚磷酸钙沉淀后便转化为八聚体。这个结论只适用于一个不含蛋白质残基的模型体系中。我们所做的P和Ca曲线的变形也可以表明这种热致的磷酸钙盐的变化。此外，pH值随时间的变化也反映了磷酸根的离子化变化——在产生热致盐沉淀时减少。而在柠檬酸盐和磷酸盐之间的反应并不影响pH值的变化，因为这两种盐的沉淀对pH值的变化有相同的影响。

将牛奶加热到85℃保温40min后分别冷却到4℃、20℃、40℃和60℃后测定牛奶中盐的变化。时间-浓度曲线表明Ca、P和pH值变化是二级反应。85℃保温40min的热处理效果加大了第二步反应的变化。由于其他成分（Mg和柠檬酸盐）的影响使结果具有多样性，只能计算出Ca和P的可逆性，分别有90%～95%和93%～99%依赖于冷却温度。Pouliot（1989）还讨论了热致变化的可逆性，特别是冷却可能导致的磷酸钙和柠檬酸钙沉淀的分解平衡。

85℃加热后在4℃保温1440min后有90%～95%的钙沉淀被重新回收，这与Rose和Tessier（1959）的结果一致，即4℃冷却后有75%～90%的热沉淀的Ca和P重新分散；也与Hilgeman和Jenness（1951）的结果没有很大不同，即4℃冷却48h后100%的热致Ca和P变化发生反向变化。

表2-3的数据显示Ca的可逆性大于P，因为此时的数据大于加热时获得的数据，接近于1.00。这似乎与从表2-4中计算的数据相反。一个可能的解释也许是冷却后与酪蛋白结合的Ca及一些热致沉淀的磷酸钙重新分散，因此可溶性Ca的水平又恢复了。较高的冷却温度获得较高的（Ca+Mg）/P值，这可能是由于较低的pH值促进了已结合的Ca的分散。生乳组分从胶态转变为可溶态的组分。

与时间相关的Ca、P和pH曲线表明盐沉淀的可逆性依赖于冷却温度，因为每一个冷却温度都有不同的平衡值。表2-4的数据进一步证实了可逆的变化依赖于温度（Pouliot et al.，1989b）。没有像在加热条件下各离子变化那样的尖锐曲线，一般而言起始浓度增长不像加热时有相应的下降。与加热反应相比，对浓度变化程度而言，第二步的变化更为重要。如果认为体系是完全可逆的，则不存在这种不同。从胶束相中释放出盐似乎是由不同的机制所控制的。

现在还不能确定观察到的柠檬酸根的可逆性和多样性是与结合产生热沉淀的磷酸钙相关，还是因为沉淀的柠檬酸钙很低的溶解性而造成的。Boulet（1996）建议在碱性条件下沉淀的牛奶中胶束态的磷酸钙可能与一些柠檬酸根结合。另外的研究（Boulet and Marier，1960）显示在低的离子强度下柠檬酸钙显示出较低的溶解性，Pouliot（1989）也证实至少与柠檬酸盐沉淀的低可逆性有部分的联系。

为了解释在冷却过程中发生的现象，我们必须考虑在形成热致沉淀盐形成过程中相关的可能发生的变化。如果我们假设沉淀的磷酸钙在加热过程中转化为一个更碱性的形式，还不甚清楚是否在冷却过程中存在从沉淀的物质或酪蛋白胶束自身的钙中解离的现象。但是由于在冷却过程中发生的反应与在加热过程中的反应相同，都是二级反应，所以自身的磷酸钙解离的可能性较小。

得到的数据表明加热后胶束态的磷酸钙组分间存在缓慢的再平衡过程，这样一个在磷酸钙和柠檬酸盐之间的复杂的平衡过程控制了冷却过程的可逆性。但需要对牛奶体系中磷酸钙的沉淀和解离过程加以进一步的实验研究。

六、乳的热稳定性的测试方法

乳的热稳定性是指乳在灭菌（或杀菌）处理时抵抗凝乳的能力，它通常用乳放置于一定温度油浴的容器中至凝乳生成的时间来表示，凝乳的生成通常用絮凝、胶凝或沉淀的变化来标记，油浴的温度常用120℃、130℃、140℃的固定温度。最常用的评定牛乳稳定性的方法如下：把1～2mL乳样封于玻璃管中，放于油浴中，一般标准乳用140℃，浓缩乳用120℃，固定在平台上的玻璃管应以一定的速度摇动，直至流动乳中有絮凝蛋白产生，这种方法常被称为“主观方法”（subjective method），它受实验温度、搅拌速度、玻璃管的填充量和倾斜角的影响，来自各方面的数据比较性较差。

White和Davies（1966）报道了以蛋白沉淀为基础的热稳定性的测定方法。他们通过测定经热处理后以低离心力离心沉淀蛋白质的百分率来确定稳定性，若沉淀量有迅速增加说明已经絮凝，我们称为“客观方法”，其终点较主观方法准确，缺点是费时和不能具体应用。此后许多科学家试图应用酒精实验、色泽实验、黏度变化等测定热稳定性，均未得出令人满意的结果，与油浴结果的差距较大。

Foissy和Kreifel（1984）开发了一种应用电磁系统客观自动测定热稳定性的方法，这种方法和油浴法呈很好的相关性。Dewit等人（1986）设计了一种称为Klaro图的连接计算机装置，也可应用玻璃管式黏度计，观察加热过程中流经玻璃球的时间来衡量热稳定性，若黏度迅速上升，说明此时为絮凝点。

Helmut等发展了一种自动检测奶粉溶液热凝结时间的方法。在这种装置中一个铬盘放在一个由磁铁驱动的铁活塞上，在控制下通过一个盛有少量牛奶样品的圆筒。当牛奶开始凝结时，圆筒内表面和金属活塞间的电阻大于旋转磁铁的磁力而使磁铁线圈偏离活塞中轴，从而导致线圈电流的瞬间变化，扩大后可用来停止一个数显时钟。本节主要介绍一些乳热稳定性检测的常规方法。

（一）煮沸试验

煮沸试验是牛乳新鲜度试验的一种。具体检验方法：取约10mL牛乳，放入试管中，置于沸水浴中5min，取出观察管壁有无絮片出现或发生凝固现象。如产生絮片或发生凝固，表示牛乳已不新鲜，酸度大于26°T。

（二）酒精试验

20世纪80年代以来，人们对乳的酒精稳定性的研究形成高潮，目前来说，乳的酒精稳定性主要有以下三方面的成果：

①目前已有了关于酒精应用于乳的最深入最完整的理解；

②酒精稳定性实验用于延长稀奶油酒（cream liqueur）的货架期；

③酪蛋白的酒精稳定性对研究“毛发状胶体”的空间稳定性方面有支持和启迪意义。

1.酒精稳定性的测试

一个世纪前已有乳的酒精稳定性的测试，尤其在西欧，它作为零售乳制品品质的衡量标准。将70%（体积分数）的酒精与等体积的乳混合时，若出现沉淀说明原料乳质量较差不能接受。20世纪30年代酒精试验用于测定乳是否变酸、混合初乳是否是乳房炎乳。20世纪上半叶人们以酒精试验和滴定酸度作为无菌浓缩产品原料乳适应性的标志，开始时结果是令人满意的，Dehlberg和Garner（1921）认为酒精试验对于测定浓缩产品原料乳质量是具有实际意义和可信的，但这种期望没有变成现实。Ramsdell等人（1931）认为酒精试验不能用于灭菌产品乳分级的判定标准。White和Davies（1956）在乳热稳定性实验中认为凝乳时间和乳对酒精敏感性之间没有必然关系，他们也承认没有发现二者的关系部分原因是因为忽视了两种凝乳现象的机制。Samuelsson等人（1962）发现酒精稳定性和UHT乳的沉淀程度相关。Zadow等人（1983）注意到酒精诱导和UHT诱导不稳定性的关系，尤其是关于pH值、Ca^2＋的影响。

2.酒精稳定性和酪蛋白结构

（1）酒精和酪蛋白胶体空间稳定性的关系

若溶剂环境不利，蛋白质和其他多聚体的构象变化，分子的有效体积减小，这种构象的“崩塌”形态常引起蛋白质分子的凝聚。酒精作用于胶体粒子产生絮凝可能缘于对酪蛋白有保护作用的κ-酪蛋白的解离并破坏了它的空间稳定性。Horne（1984）测定了酪蛋白胶体的流体力学半径，达到凝集浓度的酒精添加使其半径减小了约10nm，但随着酒精浓度通过临界值，流体力学半径通过最小值而迅速膨胀，这是由凝集引起的。

酪蛋白胶体半径下降是其均匀球体收缩或其“毛发状”外层构象变化的结果，表面现象的变化类似于凝乳酶诱导凝集的变化，无酒精存在的情况下添加凝乳酶半径下降约5nm，无凝乳酶当16%（体积分数）的酒精存在时，胶体半径下降约8nm，再添加凝乳酶于其中，在酶诱导凝集前胶体半径没有变化。

在溶液中酪蛋白的独特折叠结构使其呈稳定性，这主要缘于疏水相互作用、氢键和静电排斥，这些因素均受有机溶剂的影响，溶剂的存在引起蛋白质变性、酶反应抑制和乳的稳定性变化及凝集。Leighton（1928）认为酒精的乳凝集缘于它对蛋白质的变性作用，Herskovits（1970）证明酒精有效性是因为酒精增加，蛋白质链长度增加或烃量增加，烃化合物的支链倾向于减少这种有效性，随着烃基量增加也是如此。Horne和Parker（1981）用酒精作为乳的沉淀剂和Herskovits的结果是一致的，当酒精稳定性值用酒精、水混合物介电常数的函数表示时，可得到一个普遍适用的沉淀曲线，作为pH值的函数或固定pH值下钙添加量的函数也能获得沉淀曲线，据此可以断定酪蛋白的稳定性是由介质的介电常数决定的，但Herskovits的结果表明，酒精变性浓度和混合物介电常数间应是一个区域值而非单一值，说明蛋白质变性程度不能简单地看做介电常数的函数，应包括蛋白质和酒精间的多种亲和作用。

酒精明显减少了混合物的介电常数使其达到诱导沉淀的临界值，这反映出胶体粒子间的电极电势即静电排斥的重要性，Horne和Parker认为不同的溶解性钙浓度的影响主要通过影响胶体电荷来体现，Ca^2＋增加，酪蛋白结合水平增加，胶体间电荷排斥减弱，稳定性下降；反之，Ca^2＋降低，结合降低，稳定性升高，按照这种思路，酪蛋白的化学改性若增加电荷，则有助于乳的酒精稳定性。

乳酪蛋白酒精变性时“毛发状”κ-酪蛋白是“崩塌”而非脱附，胶体粒子的半径变化非常迅速，不呈时间依赖性，酒精和乳混合后立即测定胶体粒子的半径，在后续时间内关系函数的累计保持恒定，即在任何特定的酒精浓度情况下，胶体半径不随时间变化，这种恒定性仅表现在乙醇临界变性浓度以下时，超过临界的乙醇浓度，胶体半径依赖于pH值、Ca^2＋浓度和时间而增加。

（2）酒精对酪蛋白胶体作用引起的变化

上面讨论了酒精作用于乳蛋白后酪蛋白胶体粒子直径的变化，但未确定凝集的速度。胶体粒子半径崩塌后是否在高浓度酒精作用下进一步的变化如表2-5所示。随着胶体浓度的下降，将不发生凝集阶段的变化，在较高酒精浓度的情况下，胶体粒子的体积不继续下降。从表中还可看出，酒精使胶体粒子半径变小有临界值，超过其浓度以后已变化的胶体呈稳定性，即随着毛发状结构的崩塌，胶体粒子下降至一定的最小值，它被定义为“核”半径。

表2-5　添加酒精后酪蛋白胶体浓度对其流体力学半径的影响　单位：nm

酪蛋白胶体粒子的半径介于30～600nm，分散的范围和区间较大，故通常仅有平均流体力学半径的测定结果。为了避免胶体粒子分布变化引起的影响，Horne和Dalgleish（1985）试图通过引入测定障碍层流体力学厚度（barrier layer hygrodynamic thickness）的方法来表示酒精对酪蛋白作用的变化。障碍层厚度随胶体体积的增加而增加，这种结果和κ-酪蛋白外层的简单图像是不一致的；在这种模型中，可以推测无论粒子体积大小均有相同的障碍层厚度。大量研究表明，障碍层厚度测定法不能完全适用于酪蛋白胶体粒子。

钙离子浓度的增加，降低了酒精使酪蛋白胶体粒子崩塌的临界浓度，这归因于专一性的钙离子结合减少了蛋白质的负电荷，降低了内部“毛发状物”的排斥和使它们更易崩塌，这种影响类似于单独酪蛋白的钙诱导凝聚。随着pH值的升高，障碍层的强度增加，从而防止酪蛋白变化的耐受性增加，这和酪蛋白磷酸盐较大程度的离子化（pK≈6.5）引起的电荷增加的结果相一致。随着离子强度的增加，Ca^2＋和酪蛋白的结合能力下降，这种下降意味着蛋白质电荷的上升，引起κ-酪蛋白间的排斥作用和障碍层强度增加，在高离子强度下酒精稳定性的可逆，可理解为平衡时酪蛋白胶体的收缩过程最终变为主要伴随因素。

障碍层厚度不是保持不变的，从胶体核半径作为不同离子变化函数可以看出，障碍层厚度下降不仅来源于无酒精溶液中胶体流体力学半径的下降，也来自实际核半径的增加，实际核半径的增加是障碍层减少的主要原因，此时酪蛋白胶体会明显变硬，空间稳定性层从内部变薄，许多研究者认为空间稳定层具有弱凝胶的许多性质，在酪蛋白胶体中没有实际的吸附层被当做凝胶处理，但这和认为酪蛋白胶体是由构成蛋白分子广泛交联而成的微胶体粒子的想法是等同的，这种模型能很好地说明酒精作用于酪蛋白后其体积和半径的变化。由于这种模型表明酪蛋白外层“毛发状物”不仅连接于胶体表面且彼此连接，同时随着电荷下降，这种模型认为交联增加和表面层较多的核部分，即是说核半径的增加通过外层区域的进一步键合来完成，这种结合和早已在胶体内部形成的结合物理和化学性质没有不同。类似地随pH值上升，电荷增加，排斥作用随之增加，使交联作用变弱，毛发状蛋白不能伸展引起流体力学半径增加。

上述模型可通过高度交联情况下稳定性的护层较少受酒精作用来进一步验证。当稳定性层较薄体系不稳定，较多交联作用的存在情况下呈空间稳定，和交联较少的体系比较而言，其毛发状结构不易崩塌和不易受酒精影响。Horne和Davidson（1986）研究表明流体力学半径对酒精浓度的梯度变化，可表示空间稳定性外层对酒精诱导崩塌的敏感性，曲线的斜率随pH值上升线性增加。用微凝胶模式的定性说明，随pH值上升交联作用下降凝胶护层减弱而使空间稳定障碍层变“软”。值得说明的是变软不一定伴随稳定性下降，因为障碍层变软的同时也变厚，总厚度是胶体稳定性的决定因素。

（3）乳蛋白酒精不稳定性的机制

乳矿物元素的溶解性在添加酒精时被减少，Pierre认为Ca₃（PO₄）₂的沉淀是酪蛋白不稳定性的根源，这种沉淀中和了酪蛋白电荷，导致空间稳定性（排斥力）下降而使乳体系不稳定。从另一个角度来看，Ca₃（PO₄）₂的沉淀对乳有稳定作用，Horne和Davidson（1986）证实，降低Ca^2＋在溶液中的水平增加了稳定性毛发层的厚度，使酪蛋白趋于稳定，酒精诱导的Ca^2＋沉淀也导致相同的变化，即降低了游离钙的水平（使酪蛋白结合钙呈另一种形式），从而增加稳定层的厚度和增加了胶体电荷。酒精浓度越高，Ca₃（PO₄）₂沉淀越快越多。和这种有利作用相对，酒精对酪蛋白胶束的不稳定影响是加速其交联和空间稳定层的崩塌。主要排斥力的降低以数量级的大小加速胶束凝聚。Ca₃（PO₄）₂沉淀引起的电荷、构象变化速度较快，但仍需一定的时间。故若凝集反应发生的速度快于来自Ca₃（PO₄）₂沉淀的电荷、构象调整反应速度，则凝集反应发生，胶束粒子的沉淀形成。

乳酒精稳定性和pH值间的S形图也可由pH值对磷酸钙溶解性的影响来说明，乳酸化时胶体磷酸钙溶解，磷酸钙主要由小晶体构成，这种小晶体有较大的表面积，易溶解，且在酒精作用下能形成磷酸钙的再沉淀。提高pH值，促进了Ca₃（PO₄）₂的沉淀反应，改善了稳定性，需用较高量的酒精来克服已增加了的障碍层（能垒，energy barrier），即用较高浓度的酒精才能使乳胶体沉淀。

酒精稳定性随离子强度的上升而下降，这可通过高离子强度下Ca₃（PO₄）₂沉淀生成的抑制来说明，由于这种沉淀抑制作用，引起来自酪蛋白的钙离子需要量减少，从而导致沉淀酪蛋白酒精浓度的下降，这种理论是以离子强度无酒精存在下对矿物元素溶解性和磷酸盐pK值的影响为基础的。Pieere（1985）认为盐的溶解性也依赖于混合物的介电常数，矿物元素的沉淀作用能很好地说明酒精稳定性和沉淀混合物介电常数间的关系。

磷酸钙沉淀的稳定作用为乳清相组成能控制酪蛋白稳定性的想法提供了依据。当乳预热时，加热引起的Ca₃（PO₄）₂沉淀能提高酒精诱导矿物元素沉淀的有效性，故曲线向钙利用性下降的方向转移，导致稳定性的增加。

早期的酒精试验都是用未调整pH值的天然牛奶进行的。Horne和Paker（1980）改用调整pH值后的牛奶进行试验，发现了牛奶pH值与酒精试验稳定性间存在特定的关系。典型的关系曲线呈S形，见图2-8。稳定性随pH值的上升而增大。如果不断提高牛奶的pH值，胶粒稳定性随之增大。如果pH值足够大，牛奶中添加等体积的无水乙醇也不会引起沉淀。Horne等因此提出酒精试验应改为向1体积的牛奶中加入2体积的酒精溶液，用特定pH值下立即引起牛奶蛋白质沉淀的酒精浓度来表示牛奶酒精稳定性的大小。典型的牛奶酒精稳定性-pH关系曲线可以用以下四个参数来描述：S形曲线在低pH值，高pH值两臂的渐近值S_min、S_max，曲线拐点处的pH-pK值及斜率参数b。

1928年Leightion等人在其提出的牛奶酒精凝固机制中认为，乙醇使乳清蛋白变性，变性的乳清蛋白沉降到酪蛋白胶粒上引起酪蛋白的沉淀。但交叉透析实验结果表明乳清蛋白并不参与牛奶的酒精沉淀过程，牛奶pH值与酒精稳定性关系是由乳清中可扩散组分决定的，与乳清蛋白无关。乳糖和尿素的添加对曲线的影响很小。而牛奶中Ca^2＋的加入则使曲线向右向下移动（移向高pH值方向），但S_max、S_min值的变化并不大。以EDTA处理除去Ca^2＋产生相反的作用，整个曲线移向低pH值方向。添加磷酸盐或柠檬酸盐螯合Ca^2＋，产生相同的效果，作用能力与Ca^2＋螯合能力相一致。这一发现与1958年Danies和White提出的天然pH值的牛奶其酒精稳定性与奶中Ca^2＋浓度呈显著的相关性（见图2-9），一般看法是：当提高牛奶pH值时，由于二次电离的磷酸根离子的影响，游离Ca^2＋浓度下降，牛奶乙醇稳定性升高；pH值降低时有更多的Ca^2＋被释放，乙醇稳定性下降。图2-8的关系曲线之所以会在这一pH值范围内出现一个拐点是与磷酸根的电离特性分不开的。牛奶的乙醇稳定性是由游离Ca^2＋浓度所决定的，盐平衡比率则是通过对Ca^2＋浓度的影响而起作用的。

预热、浓缩等加工处理对牛奶的酒精稳定性也会产生影响。奶预热时，由于磷酸钙的形成可溶性钙减少，酒精稳定性增大。Horne和Parker的研究发现原料奶的组成与浓缩奶的酒精稳定性存在确定的关系，如果奶pH值较高，即在S形曲线的碱性侧，浓缩对牛奶的酒精稳定性影响则很小。这与在正常浓度牛奶中添加NaCl后出现的情况很相似。将pH值固定时，牛奶酒精稳定性与奶中Cl^－浓度作图，可以发现，pH值在6.8以上时牛奶的酒精稳定性线性下降。用浓缩或直接添加Cl^－的方法提高Cl^－浓度，所引起的结果都相似。这表明对pH值高于天然牛奶的牛奶浓缩物，其酒精稳定性是由系统中的离子强度所决定的。通过浓缩前进行透析处理除去部分Cl^－方法，可提高浓缩物的酒精稳定性。

通过比较脱脂牛奶的乙醇稳定性和在乙醇缓冲液中的酪蛋白胶束的聚集稳定性的数据可以发现，当调整Ca^2＋和pH值时，绝对稳定性和相对反应发生了变化，并且脱脂牛奶和乙醇缓冲液中的酪蛋白胶束的实验结果正好相反。增加离子强度调整pH值到7.0则降低了酒精稳定性；若增加缓冲液的离子强度却增加了酪蛋白胶束的酒精稳定性。因此可以提出如下假设：酒精稳定性的不同是由于将乙醇加入脱脂牛奶中同时发生的磷酸钙的沉淀引起的。从酪蛋白盐胶束中分离出钙，正好抵消了乙醇导致的胶束不稳定。这去除钙和结构的重组是动态控制的，当胶束凝结时间达到结构重组时间时，最终发生脱脂牛奶中胶束沉淀。

（三）热稳定性与酒精稳定性的相关性

测试牛奶的热稳定性主要有两种方法：①测定在一预先选定的温度下凝块形成的时间；②测定pH值调整后的牛奶迅速（2min内）出现凝固所需的温度。本节主要讨论后一方法的实验结果，这一方法最早是由Miller和Sommer提出的。典型的牛奶pH值与热凝固温度关系曲线见图2-10。该曲线与酒精稳定性曲线很相似，也呈S形，低pH值时稳定性最低，高pH值时稳定性最大。酒精稳定性函数表达式对热稳定性数据也适用，但热稳定性曲线pK值较小，曲线较靠近pH轴原点。

图2-10也给出了钙、磷的添加对牛奶热稳定性的影响。钙离子的添加或除去对热稳定性的影响与对酒精稳定性的影响相似。Ca^2＋浓度提高时，牛奶稳定性下降，曲线移向pH轴右方；用Ca^2＋螯合剂降低牛奶中有效Ca^2＋浓度时，稳定性增加，曲线移向低pH值方向。磷酸盐对牛奶热稳定性能产生显著的影响，柠檬酸盐（5mmol/L）也同样有效。但添加磷酸盐对pK值的大小几乎不产生影响。

试验表明牛奶的酒精稳定性和热稳定性之间有很好的相关性。两者对pH值调整具有相同的反应，对Ca^2＋浓度变化的反应至少在定性方面是一致的，这种相似表明影响两种试验结果的可能是同一反应途径。我们知道酪蛋白胶粒之所以能稳定存在是由于颗粒间存在足够大的排斥能，能防止沉淀的出现，根据Arrhenius公式：

lnK=lnA-E/（RT）

式中　K——反应速率常数；

A——碰撞频率因子；

R——摩尔气体常数；

T——热力学温度；

E——活化能。

光散射研究表明，次临界浓度的乙醇使胶粒外具有空间位阻作用的毛发样结构皱缩，失去空间位阻作用，但这时的牛奶体系中仍存在一种排斥性静电组分，聚集前必须将其克服。为了方便可做简化处理，把活化能E写作：

E=N₀εψ²

式中　N₀——阿伏加德罗常数；

ε——介电常数；

ψ——静电表面势。

因此lnK=lnA-N₀εψ²/（RT）。

这样，当酒精浓度提高时，介电常数ε减小，lnK增大直至出现迅速凝集。当然温度的提高也可增大lnK值使蛋白发生热凝固。这首先需要假定牛奶发生迅速凝固的各种情况下表面势ψ值大小都接近，这一点还有待证明。

本节主要沿用Miller和Sommer的定义讨论了pH-牛奶热凝固温度与酒精稳定性曲线间的相关性。而现今研究牛奶热稳定性时更常用的是测定标准条件下（对正常浓度牛奶为140℃，对浓缩奶为120℃）发生凝固所需的时间，这已成为牛奶热稳定性研究的标准方法，近年有关热稳定性研究的报道及机制探讨主要建立在这一标准方法的基础上。

（四）光散射试验

1.牛乳散射理论

光散射是由相对较大（大于分子大小）的粒子造成的，粒子的折射率往往不同于其周围介质。牛乳中脂肪球和酪蛋白胶束对光散射影响较大。由于乳清蛋白和体细胞的分子相对较小、浓度低，所产生的光散射则可以忽略。

粒子将入射光向各个方向散射，如图2-11所示，图中I₀为初始发光强度。

我们可以从不同的角度（如入射光呈90°）测定散射强度，这种测定方法通常适用于粒子大小比波长小得多的悬浮体；散射强度大致与粒子的体积平方、折射率的平方呈正比关系，而与波长的4次方呈反比关系。另一种测量方法是测定浊度（系由散射造成的入射光的衰减），通常以吸光度或光密度表示。浊度同样受诸多因素影响，且因为这一技术用于大颗粒，其相互之间的关系就更为复杂。

脂肪球是相对比较大的球状颗粒，若其浓度足够低的话，则可较容易地计算出浊度大小。对于可见光来说，吸光度A可近似地通过下式计算：

A=0.5τV （L/λ）

式中　V——脂肪球体积；

L——光路长度；

τ——比浊度；

λ——波长。

乳脂肪比浊度与d/λ之间的关系可由图2-12给出（其中d为脂肪球直径），图中所示仅是一种较为理想的简化模型，因为比浊度还受到仪器设置等因素的影响。脂肪球和等离子体的折射率差异会影响浊度的大小，并随着波长的变化而变化。乳脂肪的折射率波动很大，其变化范围为1.452～1.457。脂肪球的大小不一是造成浊度曲线变宽变平坦的原因；脂肪球的不均匀程度越高，多分散性质也越明显。根据图2-12（此时d代表的是脂肪球的平均直径）并结合公式，可以估算出A值大小和脂肪含量。乳脂肪的多分散性和折射率的测定误差较大，而测定其浊度（特别针对某一波长范围）是估算脂肪球平均直径和分散度的方便有效的方法。

酪蛋白胶束比脂肪球要小得多（d/λ=0.02～0.50），因此其散射光也少。胶束的不均匀性是造成散射结果复杂的原因。当胶体磷酸钙的含量增加时，其散射强度也大大增强。

牛乳是一个浓缩分散体，对于一事先未经稀释的牛乳来说，其散射理论将更加复杂。当离子间距接近或小于一个波长大小时，散射将被削弱。另一种复杂的情况就是多次散射，即光线经一次散射后到达另一粒子进行多次散射（如图2-11所示），在一未稀释的牛乳中散射次数可达到1000次甚至更多。

2.牛乳的吸收与漫反射理论

牛乳吸收可见光的能力较弱。乳清中含有的核黄素是造成乳清呈黄绿色的主要原因。乳清的最大吸收波长约为0.47μm，其比消光系数为0.05cm^-1（即光路长度为1cm情况下吸收为0.05），其中有部分吸收能量以荧光（λ=0.53μm）形式释放。乳脂肪中含胡萝卜素使牛乳呈现黄色，其最大吸收接近0.46μm，比消光系数的变化范围较大。

在紫外区，蛋白质的芳香环（酪氨酸和色氨酸残基）在λ=0.29μm处有强吸收，脂肪的双键在0.22μm处有强吸收。在红外区，许多强吸水性键在λ＞1.2μm（1.7μm附近除外）时有强吸收，它使牛乳变得不透明。其他的一些化学键也有其相应的强吸收，如CH2的吸收波长为3.45μm，脂肪族为5.70μm，肽键为6.50μm（主要是蛋白质），未解离的—COOH为5.90μm，OH则在3.50μm和9.60μm附近均有吸收。根据以上吸收的强弱，可以预测牛乳主要成分的含量。

均质牛乳的漫反射谱线由图2-13给出，该谱线是通过测定经表面反射后的各个方向（镜面反射除外）的光线的数据而得到的。测定的结果，特别是整条曲线各水平的分布与实验安排密切相关。液态物质（如牛乳）的漫反射由一定厚度（通常为几毫米）的液面层中粒子产生的多次散射造成。光线在牛乳中通过的路径同样值得考虑，因为某些波长范围的光会在中途被吸收；图2-13曲线中在波长0.46μm附近出现的低谷就是光线被吸收的缘故。牛乳中β-胡萝卜素在0.46μm附近恰有强吸收，它是牛乳呈“奶油色”的主要原因。全脂乳与脱脂乳产生的漫反射的比较见表2-6。脱脂乳由于粒子较少，反射光也相对较少一些；但在短波长区域，由于没有β-胡萝卜素的吸收其反射率则高于全脂乳。酪蛋白反射短波蓝色光的效果比反射红色光要好，这是脱脂乳呈蓝色的主要原因。脱脂乳中核黄素在波长为0.45μm处有少量吸收。表2-6还表明均质能增强漫反射，这使牛乳增白；色差虽然很小，但肉眼可以观察到。

热处理能使牛乳的颜色发生改变。从图2-13看出，加热刚开始的时候，牛乳稍微有点变白；通常将这一现象归因于乳清蛋白变性造成散射粒子的增多，但似乎更主要的原因是酪蛋白胶束的胶体磷酸盐含量上升所致。随着加热程度的增强，将发生美拉德反应，反应产生的褐色素将明显改变反射图谱，特别是在短波长区域。在实践中，我们通常采用与标准色泽比较的方法，通过感官（色觉）来评估加热产生的褐变程度。

光线穿过乳制品的状况对于某些光触反应来说非常重要。任何光线通过一浑浊溶液时都将被反射（包括漫反射）或被吸收。散射吸收得越多，光线深入的深度越浅，如表2-6所示。在这里穿透定义为光线深入液体的厚度，同样这一特性也与具体的实验条件密切相关。