实验二 抗原抗体沉淀反应
一、单向琼脂扩散试验
实验目的
1.掌握 单向琼脂扩散试验的原理及用途。
2.熟悉 单向琼脂扩散试验的操作方法与结果观察。
基本原理
单向琼脂扩散试验是一种定量试验。将抗体与琼脂混合，浇注于单扩板上打孔。实验时在孔中加入相应可溶性抗原，抗原向四周扩散，与凝胶中的抗体反应。二者在比例适当的位置形成白色沉淀环。
实验材料
（1）彩色抗IgG、IgA、IgM单向琼脂扩散板（成品）。
（2）待测人血清（抗原）。
（3）微量加样器、37℃培养箱等。
实验方法
1.加样 用微量加样器加样（勿溢出孔外）。测IgG加5μl待测人血清；测IgA加10μl待测人血清；测IgM加15μl待测人血清。
2.扩散 将单向琼脂扩散板平放于湿盒内，平置于37℃培养箱扩散24小时（IgM含量偏高，沉淀环不清楚，可放置48小时），观察结果。
实验结果
测量沉淀环：用免疫测量仪或直接在单向琼脂扩散板的背后印的刻度上读出每孔扩散后的直径，再从IgG、IgA、IgM含量表中查出相应的含量（图1-2-1）。
图1-2-1 单向琼脂扩散试验沉淀环模式图
正常血清中免疫球蛋白含量：
（1）IgG 8～14.5mg/ml。
（2）IgA 1.1～2.8mg/ml。
（3）IgM 0.7～1.9mg/ml。
注意事项
血清加样时避免污染，同时确保加样数量准确。
临床意义
单向琼脂扩散试验操作简便、成本低廉，在临床上主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中补体的含量。
二、双向琼脂扩散试验
实验目的
1.掌握 双向琼脂扩散试验的原理及用途。
2.熟悉 双向琼脂扩散试验的操作方法与结果观察。
基本原理
双向琼脂扩散试验是将可溶性抗原与相应抗体，分别加入琼脂板上相邻孔。抗原抗体各自向四周扩散，二者在扩散过程中相遇，在比例适当处形成白色沉淀线。
实验材料
甲胎蛋白（AFP）血清或脐带血、AFP免疫血清、待检血清、1%琼脂（生理盐水配制）、载玻片、微量加样器、打孔器、37℃培养箱等。
实验方法
1.浇板 取已溶化的1%琼脂（0.05mmol/L、pH 8.6巴比妥缓冲液配制）浇注于载玻片上，制成琼脂板。
2.打孔 使用打孔器在琼脂板上打孔（图1-2-2），孔径3mm，孔间距4～6mm。
3.加样 用微量加样器加AFP免疫血清于A孔，a、d孔加AFP血清，b、c、e、f孔加待检血清，每孔量均为10μl。将加样琼脂板置于37℃培养箱里，24小时后观察结果。
实验结果
琼脂板a、d孔为阳性对照。若b、c、e、f孔与A孔间出现沉淀线，且与阳性对照出现的沉淀线相吻合即为阳性；若无沉淀线或沉淀线与阳性对照沉淀线交叉，则为阴性（图1-2-2）。
图1-2-2 双向琼脂扩散试验结果
注意事项
血清加样时避免污染并注意避免外溢和出现气泡，同时确保加样数量准确。
临床意义
双向琼脂扩散试验操作简便、成本低廉，临床上常用于检测AFP，辅助诊断原发性肝癌。
三、火箭免疫电泳试验
实验目的
1.掌握 火箭免疫电泳试验的原理及用途。
2.熟悉 火箭免疫电泳试验的操作方法与结果观察。
基本原理
火箭免疫电泳又称电泳免疫分析，是单向琼脂扩散和电泳技术结合的实验。在电场作用下，抗原在含定量抗体的琼脂板中泳动，两者比例合适时，形成火箭形的锥形沉淀线，锥形沉淀线的高度与抗原量呈线性关系。因此用本试验可以测定样品中抗原的含量。此法与单向免疫扩散法比较，优点是精密度较高，耗时较短，但不足之处是操作技术复杂，影响因素较多。
电泳时，琼脂内的抗体不动，而加样孔中的抗原因迁移率不同而发生移动，当抗原分子发生移动时，抗原过量，与抗体分子形成小的可溶性免疫复合物，并以缓慢速度在含有抗体的胶板内移动。电泳持续，抗原分子与抗体分子达到适当比例，形成大的不溶性免疫复合物而发生沉淀，此沉淀不再移动，未与抗体结合的抗原以及较小的可溶性复合物可穿过此沉淀继续向前移动，形成新的沉淀。当全部抗原或抗体被消耗殆尽时，在该处形成一个固定“火箭”样沉淀峰。此时，即使继续电泳它也不再移动。沉淀峰的高度与检样中的抗原含量呈正相关。抗原质量浓度越高，沉淀峰也越高。检样若为Ig时，由于Ig（特别是IgG）与胶板内所含抗体（一般也是IgG）电泳迁移率基本相同，以致在加样孔的阳极和阴极侧都会形成沉淀，故被检血清（抗原）或抗体（胶板内的）需做化学处理，以改变其迁移率。
实验材料
（1）抗体（抗血清）：抗人IgG的免疫血清。
（2）抗原（检样）：标准人IgG试剂，用缓冲液配制的不同质量浓度的溶液。
（3）琼脂：pH 8.6巴比妥缓冲液配制的1.5%琼脂，溶化后于60℃保温。
（4）甲醛-巴比妥缓冲液：甲醛溶液2.85ml，0.05mol/L pH 8.6巴比妥-巴比妥钠缓冲液30ml（电泳槽缓冲液），混合后加蒸馏水100ml。用火箭免疫电泳技术分析体液中IgG含量时，需将检样用此缓冲液处理，使IgG增加负电荷，电泳时能向正极泳动，否则因电渗作用，在加样孔正、负极两个方向都会出现沉淀峰。
（5）其他：电泳仪、电泳槽、载玻片、吸管、微量加样器、打孔器等。
实验方法
1.抗血清最适稀释度的确定 一般均需经预试验选出。抗血清的双向免疫扩散的效价大致为1∶2∶5的比例关系，如双向扩散效价为8，火箭免疫电泳时一般可用1∶（16～20）稀释的抗血清（单向免疫扩散时则大致需要1∶40稀释）。预试时可围绕此效价做几个（一般3～4个）稀释度预试（如1∶10，1∶15，1∶20，1∶25）。最适稀释度的标准为∶形成的火箭形沉淀峰峰形尖锐、清晰，用标准抗原参加试品测试时，低质量浓度抗原峰高可达0.5cm，高质量浓度抗原峰高可达2.5～3.0cm（根据电泳板的大小、加样孔的直径、加样量的多少可适当调整）。
2.制板 将1.5%琼脂于沸水浴中溶化并冷却到56℃，加入用电泳缓冲液稀释的抗血清，迅速混匀，浇注于所需大小的洁净载玻片上。浇注量以保持凝胶厚度0.16cm为宜（即每平方厘米浇注0.16～0.17ml）。凝胶充分凝固后，用打孔器于板的一边距板缘1.0cm处打一排加样孔，孔径0.2～0.4cm，孔距0.3～0.4cm（在每一特定试验中，孔径、孔距、加样量均应固定，不能有大有小，有多有少）。
3.电泳 于加样孔中加注10μl检样，测IgG时检样1份加甲醛-巴比妥缓冲液4份，混匀后，于4℃冰箱放置2小时，取出后再用电泳缓冲液稀释至所需质量浓度。将加样孔一端置负极侧，两端用滤纸为盐桥，通电电泳。保持稳定电压为100V。电泳时间可根据标准参考品形成清晰、尖锐的沉淀峰而定。每块板上均应设置4～5个由低至高不同质量浓度的标准抗原参考品，以其所形成的沉淀峰为纵坐标，质量浓度（或其对数）为横坐标，制备标准曲线。
实验结果
电泳结束后直接测量峰高（加样孔前缘至峰尖，图1-2-3），从标准曲线得出检样中抗原含量；也可将板干燥、染色后分析。
图1-2-3 火箭电泳
注意事项
（1）火箭免疫电泳技术精密度比单向琼脂扩散法高。有以下几个原因∶本法标准曲线最高含量与最低含量之间的差是单向琼脂扩散法的1/3，但它们之间的距离差别（最高、最低含量的峰高之差与沉淀环直径之差的差别）较单向琼脂扩散法大3倍；本法抗原含量与峰高之间有较好的线性关系，而单向琼脂扩散法抗原含量与沉淀环直径之间线性关系较差（沉淀环直径在12～13mm抗原含量差别比5～6mm的含量要大得多）。本法是在抗原、抗体全部结合后出现沉淀峰，单向琼脂扩散法在扩散24小时后进行测量时，沉淀环常只是抗原抗体复合物的一部分，并非反应终点。
（2）选择最适抗血清的质量浓度是十分重要的，抗体质量浓度与峰高呈正比。抗体浓度高，火箭样沉淀峰低、浓、粗；抗体浓度低，沉淀峰高、淡，峰高不明显。
（3）应以标准参考品形成典型的火箭样沉淀峰作为电泳时间的依据。电泳时间不足，沉淀峰头部为圆形。
（4）加样后应立即电泳，如间隔时间太长，抗原可自加样孔向四周呈放射状扩散，以致形成短的甚至很宽的沉淀峰。
（5）所用琼脂应选择无电渗或电渗很小的，否则火箭形状不规则。
（6）标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源（电流要小）后再加样，否则易形成宽底峰形，使定量不准。
（7）做IgG定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火箭峰因电渗呈纺锤状。为了纠正这种现象，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），使本来带两性电荷的IgG变为只带负电荷，可加快电泳速度，抵消电渗作用，从而出现伸向阳极的火箭峰。
（8）火箭免疫电泳试验作为抗原定量只能测定标本中“μg/ml”以上的含量，若低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。加入少量125I标记的标准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的放射自显影技术。根据自显影火箭峰降低的程度（竞争法）可计算出抗原的浓度。放射免疫自显影技术可测出标本中“ng/ml”水平的抗原浓度。
临床意义
常用于IgA、IgG等蛋白检测。
四、对流免疫电泳试验
实验目的
1.掌握 对流免疫电泳试验的原理。
2.熟悉 对流免疫电泳试验的方法及特点。
基本原理
在pH 8.6的琼脂凝胶中，抗体只带有微弱的负电荷，且因为它分子较大，所以泳动慢，受电渗作用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，所以在电泳时抗体反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但它仍能向正极泳动。实验时将抗体置于阳极，抗原置于阴极，电泳时，两种成分相对泳动，反应一定时间后抗体和抗原将在两孔之间相遇，并在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线。由于电泳的作用，不仅帮助抗原抗体定向移动，同时加速了抗原抗体运动速度，而且也限制了在琼脂扩散时，抗原抗体向四周自由扩散的趋势，所以提高了反应敏感性。本法比单纯的琼脂扩散实验的灵敏度要高10倍以上，且反应时间短。
实验材料
1%琼脂、脐带血清（含AFP）、AFP免疫血清、生理盐水、载玻片、打孔器、电泳仪等。
实验方法
1.浇板 将溶化的1%琼脂3～4ml浇注于载玻片上，制成琼脂板。
2.打孔 用打孔器按图打孔（图1-2-4），孔间距为4～5mm。
3.加样 将AFP免疫血清加至靠正极侧的孔中，将脐带血清加至靠负极侧的孔中。将加样琼脂板置电泳槽上，抗原孔靠负极，抗体孔靠正极，用纱布条将琼脂板两端与电泳槽内缓冲液相连，接通电源，控制电压在4～6V/cm（玻璃长度），或电流为3～4mA/cm（玻璃长度），电泳45～60分钟。
实验结果
关闭电源后，取出琼脂板。在含AFP的脐带血清孔和AFP免疫血清孔之间可见白色沉淀线（图1-2-4）。
图1-2-4 对流免疫电泳实验结果
注意事项
血清加样时避免污染，同时确保加样数量准确。
临床意义
对流免疫电泳试验操作简便、反应时间短、敏感性高、成本低廉，在临床上可用于各种蛋白的定性和半定量测定。